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本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验研制，逆转录和PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR扩增的反应缓冲液和实验中所必需的其它组分。UltraRT逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解。该逆转酶逆转录效率高，可对少量RNA模板进行良好的逆转录反应。PCR反应使用的快速热启动DNA聚合酶具有扩增效率高、特异性强、延伸速度快的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。使用本试剂盒扩增得到的目的产物3'端附有一个″A″碱基，可直接用于T/A克隆。

• 在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
  
• 实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
  
• 本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
  
• 本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-PCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件来设计。

• 将RNA模板、引物、One-Step RT-PCR Buffer、UltraRT One-Step RT-PCR EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
  
• 根据以下表格配制反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×UltraRT One-Step Buffer	12.5μL	1×
  Forward Primer，10μM	1μL	0.4μM
  Reverse Primer，10μM	1μL	0.4μM
  UltraRT One-Step Enzyme Mix	0.5μL
  RNA Template	Xμl	1pg～1μg
  RNase-Free Water	至25μL

  
  注意：引物浓度请以终浓度0.1～1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
  
• 涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
  
• 将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，进行RT-PCR反应。
  反应条件：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  反转录	45℃	30min	1
  PCR预变性	95℃	2min	1
  变性	94℃	30s	30～40
  退火	55～65℃	30s
  延伸	72℃	30s
  终延伸	72℃	5min	1

  注意：
  
  • 一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20～30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
    
  • 延伸时间根据扩增的片段大小设定，本制品中包含的DNA Polymerase扩增效率为1kb/30s。
    
  • 可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
• 反应结束后取5μL反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。